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全自动质粒提取系统 质粒dna的提取 德国amaxa公司

所在单位仪器编号:1251
中文名称:全自动质粒提取系统
生产制造商:德国amaxa公司

规格型号:Biorobot3000
主要技术指标:自动96/384孔板加样系统
主要功能及特色:根据客户的不同需要量身定做分子生物学平台。软件功能强大,用途广泛。在平台上可以进行吸液、分液、稀释、混合、振荡、过滤、依次移液等生物学实验室中常用的工作,使得BioRobot3000既可以自动完成核酸、重组蛋白纯化,也可用于移液。根据客户的需要还可以设计成与各类仪器整合使用,如PCR仪、酶标仪等,能满足各种实验需要。
主要学科领域:
仪器主要用途:教育
所属单位:西南大学

 

质粒DNA提取实验


质粒DNA提取可以:

(1)快速纯化质粒;(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

实验方法原理:

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。

 

实验步骤:

一、材料与试剂准备

1.  材料:大肠杆菌。

2.  仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪。

3.  试剂:

(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高压灭菌,4℃保存。

 

质粒提取的几种方法及原理

 

1、碱裂解法原理:


根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下,细菌的细胞壁和细胞膜被破坏,基因组DNA和质粒DNA被释放出来,线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性,但两条互补链仍会互相盘绕,并紧密的结合在一起。


当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时,共价闭合环状质粒DNA复性快,而线性的染色体DNA复性缓慢,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。


2、煮沸法裂解:


将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性。但是,闭环质粒DNA彼此不会分离,这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构,当温度下降后,闭环DNA的碱基又各自就位,形成超螺旋分子,离心除去变性的染色体核蛋白质,就可从上清中回收质粒DNA。


煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制备),多至250mL(大量制备)菌液的质粒,并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。


质粒提取的常见问题及解决办法


1、菌液较多:可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳,菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。未彻底混匀的菌块会影响裂解,导致提取量和纯度偏低,菌体悬浮后若有较多的气泡也会影响裂解,导致导致提取量和纯度偏低。


解决办法:质粒提取使用的溶液I主要是悬浮菌体,溶液II裂解菌体,其中的高浓度NaOH破会细菌细胞壁和细胞膜,使菌体中的质粒DNA释放出来,溶液III主要是中和溶液,使溶液恢复中性环境,利于质粒DNA复性,溶液II中SDS的Na+会被K+置换,SDS变为PDS并结合大分子的基因组DNA,蛋白质和细胞碎片形成不溶物,然后通过离心可以得到含有质粒DNA的上清。


因此加入溶液II后要温和地混合,不要剧烈震荡,以免使基因组DNA断裂污染质粒。所用时间不应超过5min,以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮,可能是由于菌体过多,裂解不彻底,若继续进行后续操作会得到鼻涕状的沉淀,无法通过离心分离得到含有DNA 的上清液,因此在加入溶液Ⅱ后菌液没有变清亮后可以适当按比例加大溶液Ⅱ和后续溶液Ⅲ的用量。


2、菌液培养时间:使用TB培养基培养菌液的时间一般在17小时左右,菌液OD值在2.5-2.6左右为佳,培养时间短会导致菌体生长不充分,培养时间过长菌体会出现死亡,都会影响收集的菌体量,从而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前,可以将保存的菌种先进行活化,然后再接菌,可使过夜培养的菌液生长更充分,在一定范围内菌体量的增加,可以提高所提质粒的浓度。


3、宿主菌株:宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株,HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它们的衍生菌株,通常因为内源核酸酶的存在,或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下,将会显著影响最终收获量,或者纯化到的质粒容易降解,推荐将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中,如Top10, DH5a进行质粒纯化。


4、质粒拷贝数低:由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体,或者加大提取的菌液量,并减小洗脱时的体积。


5、菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。有时菌种保存一段时间后会出现质粒丢失的情况,导致无法提出质粒,若有保存的质粒可以转化后再挑取单克隆摇菌提质粒。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。


6、碱裂解不充分:使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加裂解液的用量。菌体沉淀未能充分悬浮或悬浮后有较多气泡也会导致裂解不充分,要注意让菌体充分悬浮并将较多的气泡用移液器吸出。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用试剂盒溶液,可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。


7、溶液使用不当:溶液II在温度较低时可能出现浑浊,可置于42℃水浴保温片刻直至溶解为清亮的溶液,方可使用。


8、吸附柱过载:不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基,例如TB或2×YT,菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率,则需减少LB培养液体积。


9、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) :洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。


10、乙醇残留:漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,再加入洗脱缓冲液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,可置于室温静置20-30分钟,或放到超净台上风吹15分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。


11、洗脱液加入位置不正确:洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。若第一次没有将洗脱液准确加到硅胶膜的中心部位,可以离心后将离心下来的洗脱液按正确方式重新上柱再次洗脱。


12、洗脱液不合适:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值,最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用,有利于提高洗脱效率。


13、洗脱体积太小:洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。


14、 洗脱时间过短:洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时在说明书的建议时间基础上适当延长静置或者洗脱两次可达到较好的效果。

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